ROJO CONGO
Fundamento teórico
La tinción de Rojo Congo es una técnica histoquímica usada para detectar depósitos de amiloide en tejidos.
Actúa gracias a un colorante aniónico (con carga negativa) que presenta alta afinidad por las proteínas amiloides, especialmente por su estructura en láminas β-plegadas. Se une a ellas mediante interacciones electrostáticas con grupos con carga positiva y mediante la formación de puentes de hidrógeno, permitiendo que sus moléculas lineales se dispongan de forma paralela a dichas estructuras. Como resultado, el amiloide se tiñe de color rojo o salmón en microscopía óptica. Además, la complejidad de la molécula del colorante favorece la formación de enlaces estables que dificultan la biodegradación y la fotodegradación de la muestra, mientras que su organización ordenada da lugar a la característica birrefringencia verde manzana bajo luz polarizada. Esto lo convierte en un método diagnóstico clave en histopatología para la detección de sustancias amiloides en los cortes histológicos.
Por otra parte, al ser una sal disódica funciona como indicador de pH, cambiando su coloración según el entorno: se teñirá de azul-violeta en casos de pH ácido, y rojo en casos de pH neutro o básico.
Los colorantes que componen la tinción de Rojo Congo son:
- Solución de Rojo Congo: sustancia que tiñe las fibras amiloides de un color rojo ladrillo y bi-reflectante en luz polarizada. Es un colorante ácido que se une a las estructuras beta-plegadas del amiloide.
- Tampón básico de diferenciación: se encarga de la eliminación del exceso de solución de Rojo Congo que no se haya unido, logrando así una mayor especificidad de la tinción. Por lo que quedan teñidos los amiloides y el resto decolorado.
- Tampón fosfato solución: se encarga de mantener un pH óptimo durante la tinción, ya que el Rojo Congo depende del pH para su unión correcta a los amiloides.
- Hemalumbre de Mayer: se encarga de teñir los nucleos de color azul. Esto sirve como contraste para observar mejor las otras estructuras del tejido.
La tinción de Rojo Congo se utiliza clínicamente para la identificación de depósitos amiloides en los tejidos. Por lo que ayudan al diagnóstico de:
- Amiloidosis: confirma la presencia de amiloidosis en biopsias de varios órganos como riñón, corazón, hígado, tracto gastrointestinal.
- Identificación de placas seniles: son acumulaciones de proteínas beta-amiloides en el cerebro
- Microbiología: para la visualización de las cápsulas bacterianas.
- Histología: tiñe los eritrocitos y citoplasmas de las células.
Materiales
- Rojo Congo:
- 1g Rojo Congo en polvo
- 100 mL de etanol 80%
- NaOH
- Agua destilada / corriente
- Balanza y vidrio de reloj
- 2 vasos de precipitados
- Probeta
- Pipetas pasteur y pipetas de vidrio (medio de montaje)
- Varillas de agitación o agitador magnético
- Embudo
- Baño maría
- Portaobjetos y cubreobjetos
- Pinzas
- Gradilla
- Cubeta de tinción
- Alcoholes (70-96-100)
- Hematoxilina de Mayers
- Xilol → campana de flujo laminar
- Medio de montaje (DPX)
- EPIs
Medidas de seguridad
- Uso de guantes de nitrilo.
- Uso de bata adecuada para el laboratorio.
- Pelo recogido y uñas cortas.
- Uso de campana de flujo laminar (CFL) a la hora de utilizar el xilol, al realizar el montaje, al hacer la solución de Rojo Congo al 1% y al teñir las muestras con esa solución.
Procedimiento
Para preparar Rojo Congo al 1%: todo en CFL.
- Pesar 1g de rojo congo en el vidrio de reloj
- Añadir el colorante a 100 mL de etanol 80%
- Agitar hasta completa disolución
- Añadir 1-2 gotas de NaOH
- Homogeneizar suavemente
- Filtrar para eliminar partículas
- Almacenar en un frasco oscuro
Para realizar la tinción:
- Desparafinar y rehidratar
- Cubrir todos los portaobjetos con Rojo Congo y dejar actuar durante 30 min en la campana de flujo laminar.
- Lavar con etanol 70% durante 30 seg.
- Lavar con agua destilada durante 30 seg.
- Sumergir en Hematoxilina de Mayer durante 7 min.
- Lavar con agua corriente durante 4 min.
- Sumergir en etanol 96% durante 1 min.
- Sumergir en etanol 100% durante 1 min.
- Sumergir en xilol 2 min (x2) en cubetas distintas.
- Montar la muestra: poner 3 gotas de medio de montaje sobre el portaobjetos, cubrir con cubreobjetos y presionar suavemente para repartir el medio de montaje. Todo ello en CFL.
Resultados e imágenes
En ambas muestras se distinguen perfectamente todas las estructuras:
En el corazón: Imagen Grupo 1
- El miocardio se observa de un color rosado claro/ grisáceo, con fibras musculares algo onduladas, correspondiente a los cardiomiocitos
- Las zonas blancas grandes son las cavidades cardíacas (ventrículos)
- Las áreas teñidas de rojo intenso, alrededor de la luz se corresponden con depósitos amiloides
Esta tinción es importante en un corte de corazón ya que permite visualizar posibles depósitos de amiloide entre las fibras musculares del miocardio, indicando una posible afectación cardíaca.
En la lengua:Imagen Grupo 1
- El epitelio plano estratificado se localiza en la parte más superficial (derecha) de color violeta / azulado debido al contraste con hematoxilina
- Se pueden diferenciar las papilas linguales en el epitelio, de coloración más morada
- La lámina propia se distingue justo debajo del epitelio, más claro
- En la parte izquierda de la imagen se observa el músculo estriado esquelético, de color rosado con las fibras alargadas
Para este órgano, el Rojo Congo es útil para identificar depósitos de amiloide en el tejido conectivo y entre las fibras musculares, lo que podría provocar macroglosia.
En el útero:imagen Grupo 6.
- La zona blanca central, con forma irregular es la luz uterina.
- El endometrio es la capa que rodea la luz, muy celular.
- Se pueden observar múltiples círculos pequeños distribuidos por todo el endometrio. Son las glándulas endometriales.
- Rodeando las glándulas se encuentra el estroma.
- El miometrio es la zona más externa, homogénea y compacta.
Aunque en este órgano es menos frecuente, el uso del Rojo Congo puede ser clave para identificar posibles depósitos de amiloide en el estroma o vasos sanguíneos.
