Fundamento teórico 

• ZIEHL-NEELSEN: algunas bacterias tienen la propiedad de resistir la decoloración con ácidos fuertes después de ser teñidas con una solución de fucsina caliente, lo que posibilita agruparlas bajo el nombre general «bacterias ácido-alcohol resistentes». 
  • La resistencia ácido-alcohol es la habilidad de absorber algunos colorantes y mantenerlos tras ser expuestos a alcoholes y ácidos. Esta propiedad se encuentra determinada por la existencia de ácidos micólicos en la pared celular, que son ácidos grasos con cadenas ramificadas de elevado peso molecular (60 a 70 átomos de carbono). Los bacilos de las micobacterias son cortos y ligeramente curvos, además de ser resistentes al ácido-alcohol. 
  • El género “Mycobacterium”, que forma parte de esta clasificación, incluye tanto especies saprófitas como especies patógenas para los seres humanos y los animales. 
  • Se tiñen las siguientes estructuras: bacilos ácido-alcohol resistentes (rojo), eritrocitos (amarillo anaranjado) y otros elementos tisulares (azul). 

Materiales 

• Hisopo, portaobjetos, pipeta de vidrio, lápiz, guantes (nitrilo), timer, pipeta Pasteur, tetina (silicona), mechero Bunsen, papel absorbente, pinza de madera, bandeja, gradilla, campana. 
• Fucsina, solución de alcohol-ácido y azul de metileno. 
• H2O corriente, etanol (70º, 96º y 100º), HCl, xilol, H2O destilada y medio de montaje DPX. 

Protocolo de laboratorio 

1. Colocar una pequeña cantidad de esputo en un portaobjetos limpio y seco, y extender con un hisopo una capa fina y homogénea sobre el portaobjetos. 
2. Dejar secar al aire. 
3. Quitarse los guantes, coger el portaobjetos con la pinza de madera y fijar la muestra pasando el portaobjetos 3-4 veces a través de la llama del mechero Bunsen. 
4. Preparar dentro de la campana el mechero Bunsen, los reactivos, la gradilla y la bandeja.
5. Cubrir completamente la muestra con fucsina. 
6. Calentar suavemente con el mechero hasta que se produzcan vapores, sin llegar a hervir (1-2 min). 
7. Dejar actuar (10 min). 
8. Lavar con agua destilada. 
9. PREPARACIÓN ALCOHOL ÁCIDO:
   1. Verter 100 ml de alcohol al 70% en un vaso de precipitados y, con una pipeta Pasteur, añadir una gota de HCl al 1%. 
   2. Transferir la mezcla resultante a una cubeta de tinción, la cual debe quedar debidamente rotulada. 
   3. Cubrir la muestra con la solución de alcohol-ácido (5 mins o hasta que desaparezca el color rojo). 
10. Lavar con agua destilada. 
11. Aplicar azul de metileno (1 min). 
12. Lavar con agua destilada y secar con papel absorbente.

Resultados e imágenes

A) Esputo negativo para bacterias del género Mycobacterium.
En esta imagen se observa una muestra de esputo teñida con Ziehl Neelsen y con el aumento 10x ya que permite valorar la calidad del extendido y localizar zonas especificas
para su análisis con mayor aumento. Esta prueba ha salido negativa para bacterias, en especial, las del género Mycobacterium, por las que se utiliza esta tinción en específico. Se
aprecia la mucosidad del esputo ligeramente teñida con la coloración aportada por el tinte y un artefacto en la preparación, lo que probablemente sea una fibra externa, introducida
durante la manipulación de la muestra. Este tipo de contaminación altera la observación de la muestra ya que puede interferir en el campo visual dificultando su interpretación,
pudiéndose identificar como estructura biológica.