PREPARACIÓN DE MUESTRAS
Grupo 3
Materiales y equipos:
1. Fijación:
● Papel de filtro.
● Rotulador permanente.
● Tabla de disección.
● Estuche de disección: tijeras, hojas y mangos de bisturí.
● Duquesitas con formol al 4%.
● Órganos.
● Campana de flujo laminar.
2. Inclusión en parafina:
● Duquesitas con las secciones de los órganos.
● Vasos de precipitados.
● Cassettes.
● Parafilm.
● Lápiz.
● Papel de filtro.
● H2O destilada.
● Etanol 70º, 90º y 100º.
● Xilol.
● Parafina.
● Frascos de cristal.
● Estuche de disección: tijeras, hojas y mangos de bisturí.
● Campana de flujo laminar.
● Estufa.
3. Formación del bloque:
● Muestras incluidas en parafina III.
● Moldes para la parafina.
● Lápiz.
● Cassettes.
● Parafina.
● Papel de filtro.
● Placa fría.
● Nevera.
● Dispensador de parafina.
4. Corte:
● Bloques de muestras en parafina.
● Lápiz.
● Portaobjetos.
● Pinceles.
● Pinzas.
● Punzón.
● Microtomo de rotación.
● Baño de flotación.
5. Desparafinación:
● Portaobjetos con muestras.
● Cubetas de tinción.
● Xileno (en campana).
● Cestilla.
6. Hidratación:
● Portaobjetos con muestras desparafinadas.
● Cubetas de tinción.
● Cestilla.
● Etanol 100º, 96º, 80º y 50º.
● H2O destilada.
Protocolo:
1. Fijación:
Se extraen y se cortan los diferentes órganos en secciones de aproximadamente 0,5 cm (máximo de 1 cm) y, se depositan los cortes en las duquesitas con formol al
4% ; previamente rotuladas con: número de grupo, órgano de estudio, número de secciones y fecha y hora de la fijación.
2. Inclusión en parafina:
Se enciende la estufa [65º] y se prepara parafina I, II, III.
Tras la fijación en formol se trasvasan las muestras a agua destilada [30 min].
Para disminuir la exposición a formol se realiza la deshidratación del tejido en etanol 70º [20 min] y, luego se realizará el tallado, colocando las muestras ya talladas en
los cassettes (se debe rotular con el número de grupo y el órgano de estudio).
Se comienza la deshidratación con el etanol 70º que, ya ha sido aplicado. Tras este, se realiza una inmersión en etanol 90º [20 min], luego en etanol absoluto [30 min] y,
por último se introduce en xilol [30 min].
Tras la deshidratación progresiva en alcoholes en orden creciente, se pasan las muestras a parafina I [30 min en estufa], donde quedan embebidas. Luego a
parafina II [1 hora en estufa] y cómo último paso a parafina III [se mantiene en parafina en la estufa].
La inclusión gradual en parafina permitirá una infiltración uniforme del tejido, asegurando la eliminación total del etanol absoluto, garantizando así muestras
adecuadas para la continuación del procedimiento.
3. Formación del bloque:
Con antelación, se enciende el dispensador de parafina y se programa; después de que la parafina se haya derretido, se procede a elegir el molde metálico respecto al
tamaño de la muestra. Se dispensa un poco de parafina líquida en el molde y se coloca la muestra en la orientación deseada, se cubre con más parafina líquida, se
sitúa el cassette rotulado con el órgano y el grupo encima y, se vierte un poco más de parafina líquida.
Se deposita el molde en el cooling plate para que solidifique la parafina, formando así el bloque; una vez el bloque sea firme, se desmolda y se rematan los bordes con
un bisturí si hay parafina que interceda.
4. Corte:
Se lleva a cabo el corte con un microtomo de rotación, se deben seguir los siguientes pasos:
1. Se revisa la llave de seguridad.
2. Se coloca la muestra en el portabloques (se debe haber tenido en cuenta previamente para realizar la orientación de la muestra y el bloque).
3. Se coloca la cuchilla en el portacuchillas o bien, si ya está colocada, comprobar que está correctamente instalada, se cierra el portacuchillas. Se
ajusta el ángulo correcto de la cuchilla.
4. Se quita el cierre de seguridad.
5. Se ajusta el grosor de las secciones (lo ideal es entre 3-5 micras).
6. Se aproxima la cuchilla a la muestra y se fija el carril de la cuchilla.
7. Se comienza a girar el volante manual para desbastar la muestra. Cuando llega a la muestra sin parafina delante, se comienzan los cortes; lo ideal es
hacerlos seriados.
8. En el momento en que los cortes de las muestras son adecuados, se recogen con ayuda de pinceles y pinzas y, se depositan en el baño de
flotación [Previamente conectado en torno a 45ºC].
9. Se rotula el portaobjetos [con lápiz] incluyendo el tejido, el grupo y el curso; p.e.: Estómago G3 25/26. Además, se deja un espacio para indicar la tinción
una vez procesado. Con la muestra estirada, se procede a su pesca. Para ello, se introduce el portaobjetos en el baño de manera perpendicular a la muestra, cuando este
cerca de la muestra se comienza a inclinar hasta pescarla, dejando la muestra pegada al portaobjetos.
10. Se deja secar la muestra en el borde del baño de flotación y se fija la muestra
al portaobjetos por completo en la estufa previamente programada entorno a
los 65ºC.
5. Desparafinación:
Una vez se tienen los tejidos fijados en los portaobjetos, estos deben pasar por una desparafinación. Se elimina la parafina porque es hidrofóbica y no permiten que las
tinciones penetren. Para ello se introducen las muestras en xileno [10 min x 2 veces]. Este paso se realiza en la campana de flujo laminar.
6. Hidratación:
A continuación se sustituye el xileno en los tejidos por agua, pero como este no es miscible en agua, se realiza una hidratación progresiva. Las muestras se introducen
en alcoholes de gradiente decreciente, comenzando por etanol 100º [10 min x 2 veces], luego etanol 96º [10 min], después etanol 80º [10 min], y por último etanol
50º [10 min]. Ahora se introducirán en H20 destilada [10 min], para que finalmente el agua penetre en los tejidos.