Fundamento teórico

Se basa en una técnica de tinción básica con propiedades metacromáticas, mediante la afinidad del colorante por estructuras con alta concentración de grupos ácidos.

• Azul de toluidina: es un colorante básico que se une a estructuras ácidas, especialmente a los ácidos nucleicos y a los componentes sulfatados de la matriz extracelular. Presenta metacromasia, por lo que puede teñir diferentes estructuras con distintos colores según su composición química. Tiñendo así las siguientes estructuras:
  • Los núcleos celulares de color azul.
  • El citoplasma de color azul claro.
  • Los gránulos de mastocitos de color púrpura o rojizo (metacromasia).
  • El cartílago y la sustancia fundamental de color violeta o púrpura.

Respecto a la utilidad diagnóstica, gracias a su capacidad metacromática, se consigue diferenciar estructuras ricas en mucopolisacáridos ácidos, lo que facilita el estudio de tejidos conectivos, cartilaginosos y la identificación de mastocitos.

Asimismo, permite observar con nitidez aspectos como la distribución de los componentes celulares, la presencia de gránulos citoplasmáticos, la organización del tejido conectivo y alteraciones en la matriz extracelular. Por ello, se emplea en el estudio de biopsias semidelgadas (incluidas en resina) y en el análisis de tejidos con alto contenido en sustancias sulfatadas.

Además, puede utilizarse como técnica rápida de evaluación en cortes semifinos, aportando una visión general de la morfología tisular antes de realizar otras técnicas más específicas.

Materiales

Los materiales utilizados para la realización de la práctica son las siguientes:

• Portaobjetos con muestra biológica ya preparada.
• Cubreobjetos.
• Cestas de tinción.
• Vasos de Coplin.
• Pipetas Pasteur o cuentagotas.
• Gradillas o soporte para portaobjetos.
• Papel de filtro.
• Pinzas.
• Guantes
• Bata

Los reactivos utilizados para la realización de la práctica son los siguientes:

• Agua destilada.
• Etanol al 70%.
• Etanol al 96%.
• Etanol al 100%.
• Xilol o xileno.
• Azul de toluidina (solución acuosa al 0,1–1%).
• Medio de montaje DPX.

Los equipos utilizados para la realización de la práctica son los siguientes:

• Campana extractora de gases.
• Balanza de precisión.
• Microscopio óptico.
• Cronómetro o temporizador.

Protocolo.

1. Fijación, inclusión, deshidratación, inclusión en parafina o resina, formación del bloque, corte, desparafinación e hidratación.
2. Montaje de batería. Se depositan los reactivos correspondientes en vasos de Coplin.
3. Se debe preparar el azul de toluidina; para ello, se disuelve el colorante en agua destilada hasta obtener una solución al 0,1–1% y se mezcla correctamente.
4. Se sumergen las muestras en el siguiente orden de reactivos:
   1. Azul de toluidina [1 a 3 minutos].
   2. Agua destilada [1 minuto x 2 inclusiones].
   3. Etanol 70º [20 segundos].
   4. Etanol 96º [20 segundos].
   5. Etanol 100º [3 minutos x 2 veces].
   6. Xileno (en campana) [10 minutos x 2 inclusiones]
5. Medio de montaje DPX. Una vez deshidratado y aclarado el corte, se deposita una gotita de medio de montaje DPX sobre la misma preparación. A continuación, se coloca con mucho cuidado el cubreobjetos evitando que se formen burbujas. La muestra se deja secar en posición horizontal hasta que se endurezca completamente, quedando dicha preparación lista para su posterior observación al microscopio óptico.

Medidas de seguridad.

Durante el procedimiento de tinción se han de tener en cuenta diferentes medidas de seguridad para proteger al personal. Se utilizan en todo momento los EPI´s, batas, guantes, y si hay riesgos por salpicaduras gafas de protección.

Los reactivos empleados durante el procedimiento, especialmente el xilol y los alcoholes, deben manipularse en zonas bien ventiladas o bajo una campana extractora, evitando de esa manera la inhalación de vapores. Se debe impedir el contacto directo de los reactivos en los ojos, piel y mucosas, y en caso de un derrame accidental, lavar inmediatamente dicha zona afectada con abundante agua.

Está estrictamente prohibido pipetear con la boca, debiendo utilizarse siempre el material adecuado. Los residuos generados durante el procedimiento de la tinción deben eliminarse conforme a la normativa actual de gestión de residuos químicos del laboratorio. Así mismo, los reactivos deben mantenerse etiquetados correctamente y cerrados tras su uso.