Fundamento teórico

La tinción PAS-Azul Alcián es una técnica histoquímica combinada y diferencial que permite identificar y clasificar mucosustancias en tejidos, distinguiendo entre mucopolisacáridos neutros y ácidos en un mismo preparado. Tiene especial relevancia diagnóstica en patología gastrointestinal, pulmonar, renal y oncológica, siendo una herramienta clave en la tipificación de lesiones preneoplásicas y neoplásicas.

El componente PAS actúa en dos etapas: el ácido peryódico oxida los grupos 1,2-glicol de polisacáridos y glucoproteínas generando aldehídos libres, que reaccionan con el reactivo de Schiff —fucsina básica decolorada— produciendo un color rojo-magenta intenso mediante una reacción de oxidación-reducción seguida de adición colorimétrica. El componente Azul Alcián, por su parte, actúa por unión electrostática: al ser un colorante catiónico, se une a los grupos aniónicos de las mucinas ácidas. A pH 2,5 tiñe tanto sialomucinas como sulfomucinas; a pH 1,0 solo las sulfomucinas, por ser estas más fuertemente aniónicas. La aplicación es secuencial y el orden es crítico —primero Azul Alcián, después PAS—, ya que invertirlo alteraría los grupos reactivos de las mucinas ácidas antes de que el colorante pudiera unirse a ellas.

En cuanto a la interpretación, el color rojo-magenta indica positividad PAS —mucinas neutras, glucógeno y membrana basal—; el azul intenso refleja positividad para mucinas ácidas; el morado o violáceo señala mucinas mixtas con doble positividad; y el azul-violeta corresponde a los núcleos celulares teñidos con hematoxilina como contratinción.

Materiales

Los materiales utilizados para la realización de la práctica son las siguientes:

• Portaobjetos con la muestra incluida en parafina
• Cubreobjetos
• Gradillas o cubetas de tinción
• Vasos de precipitados o cubetas Coplin
• Pipetas o goteros para aplicar reactivos
• Pinzas para portaobjetos
• Papel de filtro
• Guantes
• Bata

Los reactivos utilizados para la realización de la práctica son los siguientes:

• Reactivo A → Azul de Alcian
• Reactivo B → Ácido acético (generalmente al 3%)
• Reactivo C → Ácido periódico
• Reactivo D → Reactivo de Schiff
• Reactivo E → Sulfito sódico / agua sulfurosa (lavado del Schiff)
• Reactivo F → Hematoxilina
• Reactivo G → (opcional según protocolo) diferenciador o intensificador de hematoxilina
• Agua corriente
• Agua destilada
• Etanol 70%
• Etanol 96%
• Etanol 100% (absoluto)
• Xilol
• Medio de montaje

Los equipos utilizados para la realización de la práctica son los siguientes:

• Campana extractora (muy importante para xilol y alcoholes)
• Cronómetro o temporizador
• Estufa (para secado previo si aplica)
• Microscopio óptico (para observación final)

Protocolo

1. Desparafinar y rehidratar
2. Poner sobre la sección reactivo A (30 min)
3. Sin lavar, escurrir el portaobjetos y poner sobre la sección reactivo B abundante (10 min)
4. Lavar 5 minutos en agua corriente y 2 minutos en agua destilada.
5.  Poner sobre la sección reactivo C (10 min)
6. Lavar en agua destilada (2 min)
7. Poner sobre la sección reactivo D (20 min)
8. Lavar en agua destilada (2 min)
9. Poner sobre la sección reactivo E (2 min)
10. Sin lavar, escurrir el portaobjetos y poner sobre la sección reactivo F (3 min)
11. Lavar en agua destilada (2 min
12. Poner sobre la sección reactivo G (2 min)
13. Hacer virar en agua corriente (5 min)
14. Etanol 70º (30 seg)
15. Etanol 96º (30 seg)
16. Etanol 100º (2 min)
17.  Xilol (2×2 min)
18. Montar con medio de montaje

Medidas de seguridad. 

Durante el procedimiento de tinción se han de tener en cuenta diferentes medidas de seguridad para proteger al personal. Se utilizan en todo momento los EPI´s, batas, guantes de nitrilo, y si hay riesgos por salpicaduras gafas de protección.

Los reactivos empleados durante el procedimiento, como el xilol deben manipularse en zonas bien ventiladas o bajo una campana extractora. El reactivo D debe manejarse con cuidado ya que puede liberar dióxido  de azufre. Y hay que evitar el contacto directo y vapores con los reactivos B y C ya que son corrosivos.  

Los residuos generados durante el procedimiento de la tinción deben eliminarse conforme a la normativa actual de gestión de residuos químicos del laboratorio. Los restos de xilol y etanol deben de ir en contenedores orgánicos no halogenados. Los colorantes deben de recogerse en recipientes específicos para residuos químicos, nunca se deben tirar por el fregadero. 

Los reactivos deben mantenerse etiquetados correctamente y cerrados tras su uso.

Resultados

En la médula: 

• El tejido medular aparece teñido de azul intenso de forma generalizada, correspondiente a las células hematopoyéticas densamente agrupadas, con positividad para mucinas ácidas

• Se distinguen estructuras columnares o trabeculares de coloración azul oscuro, que podrían corresponder a trabéculas óseas o a cordones celulares de la médula ósea roja

• Las zonas blancas o más claras entre las estructuras celulares corresponden a los sinusoides medulares o espacios intertrabeculares

• En la zona inferior de la imagen se aprecia tejido de aspecto más laxo y fibroso, posiblemente correspondiente a la cápsula o tejido conectivo perimedular

Esta tinción es útil en la médula ya que permite identificar la presencia de mucopolisacáridos ácidos en la matriz extracelular y en los componentes del estroma medular, así como distinguir la arquitectura del tejido hematopoyético.